工业微生物分离筛选时应注意什么问题-

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1.高效性 作为工业生产用微生物应该具有的首要特性

2.能大规模培养 工业生产就是要大量生产，所以这种菌必须能大规模培养， 便于转化为生产

3.便于培养 就是培养条件不苛刻，以降低我们的生产成本

4.安全性 这种菌对人及环境必须是安全的

5.产物便于分离 菌体产生产物后应该便于我们分离

从澡堂获得一种土壤，知道里面含有嗜热菌，但不知道是什么，怎么把它培养筛选出来进行鉴定！！求详细步骤！

1、土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2、制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3、微生物的培养与观察

依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。

4、细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

这是因为土壤中各类微生物的数量（株/g）是不同的，因此，为了获得不同类型的微生物，就需要不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

（四）刚果红染色法的原理

刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（五）分离土壤中纤维素分解菌的实验设计

实验的具体操作步骤如下：

1、土样采集

土样采集的方法与上一实验设计中的类似。土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养

选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3、刚果红染色法分离纤维素分解菌

这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL无菌水的20mL大试管，温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。

刚果红染色法：

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

方法一　在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。

　方法二　配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈

土壤中微生物怎样分离纯化培养？

1、稀释平板法分离培养：取1克土壤放入灭菌的试管中，加入9毫升无菌水，充分混匀；取出1毫升稀释液，加入另一只乘有9毫升无菌水的试管中，充分混匀；再取出1毫升稀释液，加入另一只乘有9毫升无菌水的试管中，充分混匀；依次类推，分别稀释1百倍、1千倍、1万倍。从不同稀释倍数的稀释液中分别取0.1毫升，涂布与细菌培养基平板上（如LB固体培养基），放在65℃的培养箱中培养1-5天，直到有明显的单菌落长出为止。

2、菌种纯化：等有明显的单菌落生长出来后，将不同形态的单菌落，划线分离纯化，在相同的培养条件下，获得纯化的耐热菌。将这些耐热菌转接在新鲜培养基上，在30℃培养，不能生长或生长非常缓慢的可以视为嗜热菌。

3、菌种鉴定：提取细菌（一般分离出的嗜热菌都是细菌）的基因组DNA，PCR扩增其16S rDNA，送公司测序，测序结果与GenBank数据库中已知序列比对，即可获得种属信息。如果再详细鉴定，还要做生理生化试验，并与模式菌株进行比较。

1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。?

2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备?10－3、10－4、10－5

、10－6?、10－7?稀释度的土壤稀释液。?3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml?1万单位/ml链霉素）?

4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－5、10－6?三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2?、10－3、10－4?三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板）?

5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d?，观察。?

6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1)?

7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。

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